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重磅 : PD-L1蛋白表达数字化测定在非小细胞肺癌组织微阵列中的诊断应用

重磅 : PD-L1蛋白表达数字化测定在非小细胞肺癌组织微阵列中的诊断应用

  • 分类:NanoString
  • 作者:广州晟洋
  • 来源:
  • 发布时间:2020-05-07
  • 访问量:0

【概要描述】PD-L1在不同细胞中的空间表达意义十分重要

重磅 : PD-L1蛋白表达数字化测定在非小细胞肺癌组织微阵列中的诊断应用

【概要描述】PD-L1在不同细胞中的空间表达意义十分重要

  • 分类:NanoString
  • 作者:广州晟洋
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  • 发布时间:2020-05-07
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01 肿瘤免疫学生物标志物的空间表达意义

 

在肿瘤免疫疗法的领域中,非小细胞肺癌向来是备受关注的课题。一方面是由于该癌种在亚洲人群中的高发率及病情容易快速恶化,另一方面也是由于近年来多个针对基因突变的靶向疗法和肿瘤免疫疗法为非小细胞肺癌的治愈带来了新的曙光。随之以来的是多重伴随诊断手段在非小细胞肺癌中的广泛应用,从EGFR突变液体活检到基于二代测序的肿瘤突变负荷(Tumor Mutation  Burden), 研究人员都在不停探索新的生物标志物和伴随诊断手段。

 

值得注意的是,无论是靶向疗法的液体/组织活检,抑或是部分肿瘤免疫疗法提议的肿瘤突变负荷,结果都是基于大块组织或者血液中提取的DNA。然而大部分癌种都存在肿瘤异质性(TumorHeterogeneity),即是同一肿瘤组织中可能分布多个不同的肿瘤细胞克隆。另外不少研究团队亦已证明,肿瘤组织中的免疫细胞和基质细胞在肿瘤中的空间分布对患者的临床结果有着重要影响。这些发现都指向了空间信息,特别是不同细胞群落的分布以及它们的互动,极有可能是肿瘤免疫学的突破口。


 

的确,在2020年伊始,来自美国MD Andersen的Jennifer Wargo和瑞典隆德大学的Goran Jonsson团队就在《自然》杂志上背靠背发表了里程碑式的发现,通过空间生物学的手段在肿瘤组织中发现了三级淋巴结构的存在以及证明B细胞在病人存活率中的指向性作用。两篇文章的一大共同点就是利用了NanoStirng的GeoMxDigital Spatial Profiler对肿瘤组织切片中20到30个蛋白同时进行原位定量。小编之前也对这两篇文章做了详细介绍,感兴趣的老师和同学也可以深入研究 (Nature开年第三击-B细胞:肿瘤免疫疗法的秘密武器)。


 

02 PD-L1在不同细胞中的空间表达意义

 

同样,来自耶鲁大学病理学主任David Rimm教授研究团队早在2019年就通过GeoMx DSP发现了黑色素瘤中巨噬细胞的PD-L1表达 (Toki et al),较肿瘤细胞的PD-L1表达,与接受肿瘤免疫疗法病人的无进展生存期关系更为紧密。PD-L1的免疫组化染色向来是肿瘤免疫疗法伴随诊断的金标准。然而围绕该诊断存在非常多的担忧和争议,包括不同抗体试剂之间的差异以及评分方法的主观性。而且,在PD-L1阴性的患者中,亦有极个别病人表现出极优的临床效果。David Rimm教授的发现在这个未解之谜上打开了一个重大缺口,说明了PD-L1的蛋白表达需要结合空间信息及特定细胞群落分布,才可能对病人的临床效果有更好的指导。


 

03 免疫细胞的空间表达意义

 

在率先发现了PD-L1在黑色素瘤病人的巨噬细胞中的表达后,David Rimm教授团队近日又进一步探讨了非小细胞肺癌的课题(Zugazugoitia et al)。与黑色素瘤相比,非小细胞肺癌对肿瘤免疫疗法的反应率更低,因此亦需要更精确的诊断标记以求对病人分组及预后做出更好判断。


 

研究人员首先对67个接受了肿瘤免疫疗法单一治疗的非小细胞肺癌组织进行了荧光染色,根据癌组织(PanCK),淋巴细胞(CD45), 巨噬细胞(CD68)和非淋巴细胞基质细胞的表达对这四个不同区域进行了划分。然后,研究人员对选取的所有四个区域上对44个肿瘤免疫学高度相关的蛋白进行了原位测定.下图即为四个不同荧光区域的划分示意图。

图片来源(Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade innon-small-cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatialprofiling. Clinical Cancer Research 2020)

 

研究人员发现在这四个不同区间中,不同免疫细胞的空间分布对于病人预后有着预测性意义。比如淋巴细胞群落中的CD56 NK细胞和CD4 T 细胞高表达对于病人的无进展生存期和总生存期都有着良好的预后。相反,其他细胞群落中的CD56 NK细胞和CD4 T 细胞表达则与病人的预后无关。这也和之前部分研究中提示NK 细胞有可能作为肿瘤免疫疗法的生物标志物的发现吻合。然而空间信息的出现,再次证明肿瘤微环境的高度复杂性不能依赖大块组织的单一手段来解读,通过加入空间信息这一变量,不同病人组别数据的分辨度更清晰。值得注意的是,在这个实验中, 全部44个蛋白的表达量都是数字化测定,而非根据目测评分决定。因此并不存在传统免疫组分染色由于主观因素带来的偏差。

图片来源(Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade innon-small-cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatialprofiling. Clinical Cancer Research 2020)

 

另外研究人员亦发现两个新型标记物VISTA和CD127同样对于非小细胞肺癌的病人免疫疗法预后有着良好的预测效果。这两个标记物都属于肿瘤免疫检查点系统的一部分,往往在PD-1免疫抑制剂疗法中通过代偿机制升高。有趣的是,VISTA和CD127的表达升高都是体现在肿瘤细胞群落,说明这个代偿机制是肿瘤细胞对于由于免疫疗法带来的攻击产生的抵抗,有效证明了免疫疗法在这些病人当中起了积极作用。


 

04 PD-L1空间表达数字化定量

 

上文中提到过,David Rimm 教授团队在2019年就发现黑色素瘤中巨噬细胞的PD-L1表达水平与病人预后高度相关。然而在非小细胞肺癌病人中,PD-L1的表达量却在不同的细胞群落中无显著差别。这说明了即便如PD-L1这样的重量级生物标记物,在不同癌种的空间表现乃至临床预测都可能不尽相同,进一步说明了在今后的肿瘤免疫研究中,研究人员在开发伴随诊断的时候需要结合空间信息与基因/蛋白表达量。 


 

在这一方面,David Rimm教授的团队再次提出了数字化测定PD-L1 表达量的概念。在另一篇刚刚发表的文献中 (Gupta et al, 2020), 同一研究团队采用了标准化的组织微阵列和10个不同细胞株,对PD-L1的表达在不同平台上进行了测定,其中包括多个FDA认证的PD-L1免疫组化试剂盒,GeoMx DSP和免疫荧光染色。实验结果表明GeoMx DSP不仅与传统的免疫组化和免疫荧光染色结果在组织微阵列及细胞株中高度吻合,更是通过数字化的读取提供定量结果,在将来有可能会成为新的PD-L1伴随诊断手段.

 

05 组织微阵列在伴随诊断开放中的应用

 

老师同学们或许都已经注意到,David Rimm教授团队在实验中大量应用到组织微阵列。在过往,大部分的免疫组化实验都是基于大块组织切片。上文提到的MD Anderson和隆德大学的两篇文章都是基于可切除黑色素瘤,较易切除获取大块组织。然而对于非小细胞肺癌来说,由于肿瘤组织更为深入体内,往往需要细针活检或者开胸手术才能获取。这也是为什么在非小细胞肺癌中,液体活检越来越受欢迎的原因。在一般病理学分析中,大块肿瘤组织更能提供全方位的信息,当出现组织样本稀少的情况下,组织微阵列(TissueMicroarray)就成为了最佳选项。组织微阵列是通过将多个石蜡组织包块上的组织活细胞转移到一个新的石蜡块上,从而构建出微型化共同量的组织阵列,以有效地进行临床病理组织的观察和研究。虽然有部分声音对于组织微阵列备样过程中可能出现的样品污染和取样时出现以偏概全的可能性抱有怀疑,但是假如肿瘤免疫疗法的将来需要面对大规模开发新型空间生物学标志物,目前珍贵的临床样品势必面临枯竭的问题。但是通过合并高通量的空间生物学平台如GeoMx DSP和组织微阵列,研究人员也是实现在短时间内可以快速筛选蛋白或RNA生物标记物。值得注意的是,文中所用到的GeoMx DSP,提供四个荧光标记物的选项。当研究人员通过选取感兴趣区域(Region of Interest, ROI)并建立不同区块或细胞群落模型后,GeoMx DSP就可以全自动化的对一张组织微阵列上的所有样本逐一进行选样,并且在这个过程中保持样本的完整性,以便用于下一轮筛选。


 

06 展望未来

通过David Rimm教授团队的发现,我们不难看到肿瘤免疫疗法的生物标记物开发仍然有着很长一段路要走。目前PD-L1 仍是单一生物标记物的黄金标注,但是免疫组化染色存在的偏差不得不让人考虑采用数字化定量系统的可能性。此外,许多对肿瘤免疫疗法有着良好治疗反应的肿瘤中,PD-L1阳性的患者很少,种种数据都证明,除了PD-L1之外,还有更多生物标志物的空间信息及其临床意义有待发现。而且许多癌种包括乳癌和大肠癌仍是有待开发。假如老师和同学们想了解更多关于GeoMx DSP在肿瘤学中空间生物标记物的发现,可以登记参加于周四举行的线上研讨会,我们的专家将详细解释包括Jennifer Wargo, David Rimm团队在内发表于自然杂志的文献和实验思路,以期帮助研究人员更快地开拓空间生物学在肿瘤免疫学的应用。

 

文 献

1.Gupta et al, Digital Quantitative Assessment of PD-L1using digital spatial profiling:   

2. Zugazugoitia et al,  Biomarkers associated with beneficial PD-1 checkpoint blockade innon-small-cell lung cancer (NSCLC) identified using high-plex digital spatialprofiling 

3. Toki et al. High-Plex Predictive Marker Discovery for MelanomaImmunotherapy-Treated Patients Using Digital Spatial Profiling.

 

关于NanoString生物技术

自从2008年《NatureBiotechnology》期刊以封面文章形式报道了NanoString的突破性技术后,至今已有近3000篇应用该技术的生物医学文献。其中多篇文章发表在《Cell》,《NatureMedicine》等顶级杂志上。NanoString的数字化基因检测技术(nCounterAnalysis)是最新一代的多重核酸定量技术,在转化医学与临床应用中扮演越来越重要的角色。

 

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发布时间:2020-04-28 00:00:00

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